Использование метода хемилюминесценции для анализа системных свойств крови человека

Новиков К.Н., Асфарамов Р.Р., Буларгина Ю.С., Буравлева Е.В.,                       
Виленская Н.Д., Воейков В.Л. Московский государственный университет              
им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биоорганической химии,  
 E-mail: vvl@soil.msu.ru;  

Считается, что низкоинтенсивная люминесценция (НИЛ) биологических объектов -- непосредственный результат релаксации электронно-возбужденных состояний отдельных молекул, которые были возбуждены при протекании свободно-радикальных окислительных реакций, и она не играет функциональной роли. Однако процессы, приводящие к непрерывному возникновению электронно-возбужденных частиц, в живых системах протекают постоянно и закономерно. И хотя суммарный объем освобождающейся при этом энергии, по-видимому, невелик, ее высокая плотность может обеспечить протекание весьма энергоемких процессов. Основной массив данных по сверх-слабым излучениям биологических объектов в оптическом диапазоне спектра был накоплен при изучении хемилюминесценции (ХЛ), сопровождающей «окислительный взрыв» (ОВ) – генерацию активных форм кислорода (АФК) в препаратах очищенных суспензий нейтрофилов. Если для регистрации ХЛ используют цельную кровь, ее сильно разводят, так как предполагается, что гемоглобин и другие хромофоры должны полностью гасить НИЛ. Однако мы показали, что и неразведенная кровь человека может быть источником излучения, происходящего в результате вторичных процессов, обусловленных трансформацией энергии электронно-возбужденных состояний в системе. Мы исследовали спонтанное и инициированное активаторами ОВ излучение цельной неразведенной крови человека в отсутствие и в присутствии усилителей ХЛ: маркера образования Н₂О₂ люминола (ЛМ-ХЛ) или маркера образования О₂^-· люцигенина (ЛЦ-ХЛ). На параметры НИЛ существенно влияют состояние здоровья доноров, объем образца, время хранения крови до начала измерений. Препараты свежей неразведенной крови здоровых доноров обладают высокой и длительной ЛЦ-ХЛ. ЛМ-ХЛ в отсутствие активаторов ОВ наблюдается лишь через 10-12 ч после выделения крови. При разведении крови физраствором ЛМ-ХЛ возрастает с ускорением, в то время как ЛЦ-ХЛ снижается. Исключение контакта крови с воздухом почти не влияет на кинетику и интенсивность ЛЦ-ХЛ, но блокирует развитие ЛМ-ХЛ, сопровождающее развитие индуцированного в крови ОВ. Эти данные позволили предположить, что нейтрофилы могут использовать разные источники кислорода для продукции АФК. ЛМ-ХЛ регистрирует АФК, возникающие при восстановлении растворенного в среде О_2, а для роста ЛЦ-ХЛ, по крайней мере, на первых этапах развития ОВ необходим растворенный в среде кислород.  Следовательно,  нейтрофилы в неразведенной  крови постоянно продуцируют О₂^-· из кислорода, получаемого от эритроцитов. Последнее предположение подтверждается опытами с разведением крови, при котором ЛМ-ХЛ значительно снижается за счет уменьшения концентрации клеток, а, значит, и их возможности взаимодействовать друг с другом.
В пользу нашего предположения свидетельствуют результаты опытов с введением в неразведенную кровь СО (угарного газа), резко стимулирующего интенсивность ЛЦ-ХЛ. В этом случае усиление интенсивности ХЛ может быть обусловлено залповым выбросом эритроцитами О₂. Такая возможность возникает благодаря тому, что связывание молекулы СО с молекулой дезокси-гемоглобина сопровождается обсобождением значительной порции энергии. Поскольку молекулы гемоглобина в эритроцитах очень плотно упакованы, энергия может не рассеиваться, а возбуждать передаваться на соседние молекулы окси-гемоглобина, что облегчает диссоциацию кислорода и его освобождение в среду. Введение угарного газа в среду инкубации изолированных нейтрофилов, напротив, резко снижало уровень как ЛМ-ХЛ, так и ЛЦ-ХЛ. Этот эффект объясняется тем, что в отсутствие гемоглобина СО должен преимущественно связываться с гем-содержащими ферментами нейтрофилов, ответственными за продукцию АФК и блокировать их работу. Результаты экспериментов с СО позволяют выдвинуть гипотезу, что СО, продуцируемый специфическими ферментными системами клеток, которыми, в частности, богата нервная ткань, обеспечивает усиленное питание тканей кислородом.
Мы обнаружили также, что возвращение обратно в образец крови даже части излученных ей фотонов приводит к стимуляции в крови процессов, сопровождающихся усилением ХЛ. Этот эффект, предположительно, также обусловлен повышением доступности кислорода для его потребителей за счет кооперативных процессов освобождения кислорода после поглощения фотонов даже небольшим количеством молекул гемоглобина.
Совокупность полученных результатов позволяет заключить, что в цельной неразведенной крови благодаря разнообразным формам взаимодействия ее различных компонентов могут наблюдаться явления, недоступные для исследования в очищенных препаратах отдельных компонентов, что открывает новые возможности для гематологических исследований, в частности, с использованием быстрого и высоко чувствительного хемилюминесцентного метода.